Інноваційні технології для виявлення антибіотикорезистентних бактерій

Стійкі до лікарських засобів патогени спровокували кризу резистентності до антибіотиків, яка загрожує громадському здоров’ю, сільському господарству, тваринництву. Іноді резистентність збудника досліджують тільки після того, як один або кілька стандартних антибіотиків не проявляють клінічного ефекту.

Вимірювання бактеріального росту

Золотий стандарт для оцінки чутливості збудників до антибіотиків — дисковий дифузний тест — з’явився в 1889 р. Бактерії культивують на чашці з агаром, а потім розміщують крихітні паперові диски, просочені препаратами, на клітини, що зростають. Цей принцип визначення чутливості до антибіотиків автоматизований в таких системах тестування, як BD Phoenix від BD Biosciences VITEK 2 компанії bioMérieux. Системи засівають бактерії в рідкі середовища з антибіотиками та шукають оптичні зміни, що вказують на зростання або загибель бактерій.

У 2018 р. Євген Іделевіч (Evgeny Idelevich) розробив метод дослідження, заснований на технології MALDI — TOF. Це метод мас-спектрометрії, в основі якого — лазерно-індукована іонізація. Культуру патогена (наприклад Pseudomonas aeruginosa і Klebsiella pneumoniae) наносять безпосередньо на тверду матрицю-носій та інкубують кожну краплю з різними антибактеріальними препаратами. Потім обробляють зразок за допомогою системи, спеціально розробленої для ідентифікації бактерій: MALDI Biotyper від Bruker Daltonik. Інтенсивність характерних спектральних піків вказує на ступінь чутливості культури до антибіотика.

У 2013 р. Джованні Лонго (Giovanni Longo) з Національної дослідницької ради Італії (National Research Council of Italy) виявив, що при зв’язуванні патогенної Escherichia coli з мікроструктурами, які називаються кантилеверами, і у разі впливу на неї антибіотиків кантилевер зміщувався вгору і вниз через невеликі рухи прикріплених живих бактерій. Рухи припинялися, якщо збудник був чутливим до антибіотиків. Рух було видно під атомно-силовим мікроскопом протягом декількох хвилин — задовго до реплікації бактерій.

Фізик Каміл Екінчі (Kamil Ekinci) з Бостонського університету (Boston University) пропонує використовувати електричний струм. Принцип методу — перетворення зростання бактерій на електричний сигнал. Зразок сечі з домішкою K. pneumoniae, частої причини інфекцій сечовивідних шляхів, поміщають безпосередньо в канал мікрофлюїдного пристрою з антибіотиком та відстежують електричну провідність через канал. Під час розростання бактерії створюють більший електричний опір. До недоліків методу належить недостатня точність щодо патогенів, які зростають повільно, таких як M. tuberculosis.

Вимірювання молекулярних маркерів

Тести, засновані на зростанні бактерій, прості, дешеві та неспецифічні: один тест працює з широким спектром патогенів. Але результати тестів дуже залежать від умов зростання та правильної концентрації антибіотиків.

У якості альтернативи Сюзанна Хойсслер (Susanne Häussler) та інші дослідники зверталися до геноміки. Виявлення генів, які явно пов’язані з механізмами стійкості до антибіотиків, — ідеальний шлях до більш швидкої діагностики, оскільки він не вимагає тривалої бактеріальної інкубації.

Гарі Школяр (Gary Schoolnik) зі Стенфордського університету (Stanford University) розробив одноразовий діагностичний тест Visby для локального використання. Методика фокусується на мутаціях, що зумовлюють стійкість до ципрофлоксацину. Мутації в гені, що кодує фермент гіразу А, визначають різницю між штамами Neisseria gonorrhoeae, які стійкі або чутливі до ципрофлоксацину. Методика Visby обходить технічні обмеження, властиві тестам, проведеним методом полімеразної ланцюгової реакції, зводячи аналіз до простої зміни кольору. Ампліфіковані фрагменти перетікають в камеру пристрою, яка містить зонди захоплення для кожного варіанта гена. Зв’язування призводить до зміни кольору, яке відображає чутливість штаму.

Інші вчені продовжують досліджувати повногеномне секвенування, щоб охопити всі аллелі, що відповідають за резистентність до антибіотиків. Сьогодні методи, засновані винятково на секвенуванні генома, добре працюють для деяких патогенів, таких як Salmonella enterica, але мутації в декількох регуляторних генах можуть змінювати патерни експресії генів (і, отже, стійкість) інших, включаючи P. aeruginosa.

У 2014 р. Чікара Фурусава (Chikara Furusawa), біоінженер з RIKEN, вивчив лабораторні штами E. coli, що адаптуються до зростання за наявності різних антибіотиків, і встановив, що він може використовувати зміни в експресії генів для більш точного прогнозування стійкості, ніж із самими геномними послідовностями ДНК. Кореляція між експресією генів і стійкістю значно вища, ніж кореляція між стійкістю та геномними маркерами.

Прогнозування майбутньої резистентності

У своїй роботі С. Хойсслер описує поєднання геномних і транскриптомних маркерів як найкращий критерій для прогнозування стійкості P. aeruginosa до антибіотиків із застосуванням технології машинного навчання. Замість простого виявлення мутацій, що викликають стійкість, використовуються алгоритми для визначення критеріїв варіацій ДНК і РНК, які відповідають за антибіотикорезистентність штаму. Замість того щоб просто інформувати лікарів про поточний профіль резистентності патогена, ці алгоритми можуть також виявити, які механізми стійкості до антибіотиків у штаму можуть розвинутися у відповідь на лікування.

М. Фархат застосувала метод машинного навчання, який використовує повні послідовності генома для прогнозування резистентності M. tuberculosis. Вебінструмент під назвою GenTB може прогнозувати стійкість до декількох протитуберкульозних препаратів: у той час як одна поширена мутація відповідає за 80% стійкості до препаратів першого ряду, які використовуються для лікування туберкульозу, кілька рідкісних варіантів демонструють невелике підвищення стійкості до препаратів другого ряду.

Робота в процесі

Який би підхід вони не використали, дослідники стикаються з однією і тією ж фундаментальною проблемою: потрібно розробити діагностику, яка значно поліпшить характеристики  пристроїв, що вже існують.

Деякі розроблювані тести обмежені типами зразків, які вони можуть обробляти, або бактеріями чи антибіотиками, які можуть тестувати. На даний час діагностика Visby обмежена, наприклад, гонококовими інфекціями, а для мікрофлюїдного пристрою Ekinci необхідні зразки сечі, і він не визначає інфекції, викликані більш ніж одним видом бактерій. Інші, для яких потрібні сучасні мікроскопи або спектрометр, такі як кантилевери, мають бути адаптовані, перш ніж їх зможуть використовувати нефахівці, що працюють в клініках з обмеженими ресурсами по всьому світу.

За матеріалами www.nature.com